Regulierung der Genbearbeitung mithilfe von T

Feb 15, 2024

Naturpflanzen (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die Transformation über Agrobacterium tumefaciens ist die vorherrschende Methode zur Einführung exogener DNA in Pflanzengenome1,2. Transfer-DNA (T-DNA), die aus Agrobacterium stammt, kann als einzelne Kopie oder in komplex verketteten Formen integriert werden3,4, die Mechanismen, die die endgültige T-DNA-Struktur beeinflussen, sind jedoch noch unbekannt. Hier zeigen wir, dass der Einschluss von Retrotransposon (RT)-abgeleiteten Sequenzen in T-DNA die T-DNA-Kopienzahl in Arabidopsis thaliana um mehr als das 50-fache erhöhen kann. Diese zusätzlichen T-DNA-Kopien sind in großen Concatemeren organisiert, ein Effekt, der hauptsächlich durch die langen terminalen Wiederholungen (LTRs) von RTs hervorgerufen wird, die unter Verwendung von Nicht-LTR-DNA-Wiederholungen repliziert werden können. Wir fanden heraus, dass die T-DNA-Verkettung von der Aktivität der DNA-Reparaturproteine ​​MRE11, RAD17 und ATR abhängt. Schließlich zeigen wir, dass die T-DNA-Verkettung genutzt werden kann, um die Häufigkeit gezielter Mutagenese und Gen-Targeting zu erhöhen. Insgesamt deckt diese Arbeit molekulare Determinanten auf, die die T-DNA-Kopienzahl in Arabidopsis modulieren, und zeigt den Nutzen der Induktion der T-DNA-Verkettung für die Bearbeitung pflanzlicher Gene.

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Die aus dieser Studie generierten Daten sind in den Hauptzahlen, erweiterten Daten und Zusatzinformationen enthalten. Rohe Sequenzierungsdaten werden bei der NCBI SRA (BioProject PRJNA892619) hinterlegt. Bei der Analyse der Daten wurden das TAIR10-Arabidopsis-Genom (https://www.arabidopsis.org/download/index-auto.jsp%3Fdir%3D%252Fdownload_files%252FGenes%252FTAIR10_genome_release) und die Liste „Orthologe Genfamilie“ herangezogen aus der Dicots PLAZA 5.0-Datenbank (https://ftp.psb.ugent.be/pub/plaza/plaza_public_dicots_05/GeneFamilies/genefamily_data.ORTHOFAM.csv.gz). Es gibt keine Einschränkungen hinsichtlich der Datenverfügbarkeit. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Gelvin, SB Integration von Agrobacterium T-DNA in das Pflanzengenom. Annu. Rev. Genet. 51, 195–217 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gelvin, SB Pflanzen-DNA-Reparatur und Agrobacterium-T-DNA-Integration. Int. J. Mol. Wissenschaft. https://doi.org/10.3390/ijms22168458 (2021).

Justus, F. et al. Die komplexe Architektur und epigenomische Wirkung pflanzlicher T-DNA-Insertionen. PLoS Genet. 15, e1007819 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Pucker, B., Kleinbolting, N. & Weisshaar, B. Groß angelegte genomische Umlagerungen in ausgewählten T-DNA-Linien von Arabidopsis thaliana werden durch T-DNA-Insertionsmutagenese verursacht. BMC Genomics 22, 599 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chilton, MD et al. Stabiler Einbau von Plasmid-DNA in höhere Pflanzenzellen: die molekulare Grundlage der Wurzelgallen-Tumorentstehung. Zelle 11, 263–271 (1977).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Galbiati, M., Moreno, MA, Nadzan, G., Zourelidou, M. & Dellaporta, SL Groß angelegte T-DNA-Mutagenese in Arabidopsis für die funktionelle Genomanalyse. Funktion. Integr. Genomics 1, 25–34 (2000).

CAS PubMed Google Scholar

Zambryski, P. et al. Tumor-DNA-Struktur in durch A. tumefaciens transformierten Pflanzenzellen. Science 209, 1385–1391 (1980).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Baltes, NJ, Gil-Humanes, J., Cermak, T., Atkins, PA und Voytas, DF DNA-Replikons für das Pflanzengenom-Engineering. Pflanzenzelle 26, 151–163 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kralemann, LEM et al. Eindeutige Mechanismen für die genomische Bindung der 5′- und 3′-Enden der Agrobacterium-T-DNA in Pflanzen. Nat. Pflanzen 8, 526–534 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

van Kregten, M. et al. Die T-DNA-Integration in Pflanzen resultiert aus der Polymerase-θ-vermittelten DNA-Reparatur. Nat. Pflanzen 2, 16164 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jacob, Y. et al. Regulierung der heterochromatischen DNA-Replikation durch Histon-H3-Lysin-27-Methyltransferasen. Natur 466, 987–991 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Davarinejad, H. et al. Die Histon-H3.1-Variante reguliert die TONSOKU-vermittelte DNA-Reparatur während der Replikation. Wissenschaft 375, 1281–1286 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zaratiegui, M. Kreuzregulation zwischen transponierbaren Elementen und Wirts-DNA-Replikation. Viren https://doi.org/10.3390/v9030057 (2017).

Cavrak, VV et al. Wie ein Retrotransposon die Hitzestressreaktion der Pflanze für seine Aktivierung nutzt. PLoS Genet. 10, e1004115 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ito, H. et al. Ein siRNA-Weg verhindert die generationsübergreifende Retrotransposition in Pflanzen, die Stress ausgesetzt sind. Natur 472, 115–119 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wolter, F., Klemm, J. & Puchta, H. Effizientes Planta-Gen-Targeting bei Arabidopsis durch eizellspezifische Expression der Cas9-Nuklease von Staphylococcus aureus. Pflanze J. 94, 735–746 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bechtold, N., Ellis, J. & Pelletier, G. In planta Agrobacterium-vermittelter Gentransfer durch Infiltration erwachsener Arabidopsis thaliana-Pflanzen. CR Acad. Wissenschaft. III 316, 1194–1199 (1993).

CAS Google Scholar

Alonso, JM et al. Genomweite Insertionsmutagenese von Arabidopsis thaliana. Wissenschaft 301, 653–657 (2003).

Artikel PubMed Google Scholar

McElver, J. et al. Insertionsmutagenese von Genen, die für die Samenentwicklung in Arabidopsis thaliana erforderlich sind. Genetics 159, 1751–1763 (2001).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sessions, A. et al. Ein Arabidopsis-Reverse-Genetiksystem mit hohem Durchsatz. Pflanzenzelle 14, 2985–2994 (2002).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kamp, JA, van Schendel, R., Dilweg, IW & Tijsterman, M. BRCA1-assoziierte Strukturvariationen sind eine Folge der Polymerase-Theta-vermittelten Endverknüpfung. Nat. Komm. 11, 3615 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jacob, Y. et al. Die selektive Methylierung der Histon-H3-Variante H3.1 reguliert die Heterochromatin-Replikation. Wissenschaft 343, 1249–1253 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jacob, Y. et al. ATXR5 und ATXR6 sind H3K27-Monomethyltransferasen, die für die Chromatinstruktur und die Gen-Stummschaltung erforderlich sind. Nat. Struktur. Mol. Biol. 16, 763–768 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nishizawa-Yokoi, A. et al. Die Integration von Agrobacterium T-DNA in somatische Zellen erfordert nicht die Aktivität der DNA-Polymerase θ. Neues Phytol. 229, 2859–2872 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Inagaki, S. et al. Arabidopsis TEBICHI mit Helikase- und DNA-Polymerase-Domänen ist für die regulierte Zellteilung und -differenzierung in Meristemen erforderlich. Plant Cell 18, 879–892 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hussmann, JA et al. Kartierung der genetischen Landschaft der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen. Zelle 184, 5653–5669.e25 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Budzowska, M. et al. Eine Mutation des Maus-Rad17-Gens führt zur embryonalen Letalität und zeigt eine Rolle bei der DNA-Schaden-abhängigen Rekombination. EMBO J. 23, 3548–3558 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Q. et al. Rad17 rekrutiert den MRE11-RAD50-NBS1-Komplex, um die zelluläre Reaktion auf DNA-Doppelstrangbrüche zu regulieren. EMBO J. 33, 862–877 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Williams, GJ, Lees-Miller, SP & Tainer, JA Mre11-Rad50-Nbs1-Konformationen und die Kontrolle von Wahrnehmung, Signalisierung und Effektorreaktionen an DNA-Doppelstrangbrüchen. DNA Repair 9, 1299–1306 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fauser, F. et al. Beim pflanzlichen Gen-Targeting. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 109, 7535–7540 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Scheiffele, P., Pansegrau, W. & Lanka, E. Initiierung der T-DNA-Verarbeitung von Agrobacterium tumefaciens. Die gereinigten Proteine ​​VirD1 und VirD2 katalysieren in vitro die orts- und strangspezifische Spaltung superhelikaler T-Border-DNA. J. Biol. Chem. 270, 1269–1276 (1995).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ward, ER & Barnes, WM VirD2-Protein von Agrobacterium tumefaciens, sehr eng an das 5′-Ende der T-Strang-DNA gebunden. Science 242, 927–930 (1988).

Neale, MJ, Pan, J. & Keeney, S. Endonukleolytische Verarbeitung kovalenter proteingebundener DNA-Doppelstrangbrüche. Natur 436, 1053–1057 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brzezinka, K., Altmann, S. & Baurle, I. BRUSHY1/TONSOKU/MGOUN3 ist für das Hitzestressgedächtnis erforderlich. Pflanzenzellumgebung. 42, 771–781 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, W. et al. Das AtRAD51-Gen von Arabidopsis ist für die vegetative Entwicklung entbehrlich, für die Meiose jedoch erforderlich. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 101, 10596–10601 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Valuchova, S. et al. Der Schutz der Telomere mit stumpfen Enden von Arabidopsis wird durch eine physikalische Assoziation mit dem Ku-Heterodimer vermittelt. Pflanzenzelle 29, 1533–1545 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heacock, ML, Idol, RA, Friesner, JD, Britt, AB & Shippen, DE Telomerdynamik und Fusion kritisch verkürzter Telomere in Pflanzen ohne DNA-Ligase IV. Nukleinsäuren Res. 35, 6490–6500 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heitzeberg, F. et al. Das Rad17-Homolog von Arabidopsis ist an der Regulierung der Reparatur von DNA-Schäden und der homologen Rekombination beteiligt. Plant J. 38, 954–968 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Samanic, I., Simunic, J., Riha, K. & Puizina, J. Hinweise auf unterschiedliche Funktionen von MRE11 bei der Arabidopsis-Meiose. PLoS ONE 8, e78760 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Feng, W. et al. Groß angelegte Heterochromatin-Remodellierung im Zusammenhang mit überreplikationsbedingten DNA-Schäden. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 114, 406–411 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Culligan, K., Tissier, A. & Britt, A. ATR reguliert einen G2-Phasen-Zellzyklus-Kontrollpunkt in Arabidopsis thaliana. Pflanzenzelle 16, 1091–1104.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Curtis, MD & Grossniklaus, U. Ein Gateway-Klonierungsvektorsatz für die Hochdurchsatz-Funktionsanalyse von Genen in Pflanzen. Pflanzenphysiologie. 133, 462–469 (2003).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Clough, SJ & Bent, AF Floral Dip: eine vereinfachte Methode zur Agrobacterium-vermittelten Transformation von Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, 735–743 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Puizina, J., Siroky, J., Mokros, P., Schweizer, D. & Riha, K. Mre11-Mangel bei Arabidopsis ist mit chromosomaler Instabilität in somatischen Zellen und Spo11-abhängiger Genomfragmentierung während der Meiose verbunden. Pflanzenzelle 16, 1968–1978 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Molina-Risco, M. et al. Optimierung der Agrobacterium-vermittelten Transformation und CRISPR-Cas9-Genbearbeitung im Präsidium der tropischen Japonica-Reissorte. Int. J. Mol. Wissenschaft. https://doi.org/10.3390/ijms222010909 (2021).

Clemente, T. Nicotiana (Nicotiana tobaccum, Nicotiana benthamiana). Methoden Mol. Biol. 343, 143–154 (2006).

PubMed Google Scholar

Livak, KJ & Schmittgen, TD Analyse relativer Genexpressionsdaten mittels quantitativer Echtzeit-PCR und der 2(–Delta Delta C(T))-Methode. Methoden 25, 402–408 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, S. et al. Räumliche Organisation von Chromatindomänen und -kompartimenten in einzelnen Chromosomen. Wissenschaft 353, 598–602 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rouillard, JM, Zuker, M. & Gulari, E. OligoArray 2.0: Design von Oligonukleotidsonden für DNA-Mikroarrays unter Verwendung eines thermodynamischen Ansatzes. Nukleinsäuren Res. 31, 3057–3062 (2003).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sage, D. et al. DeconvolutionLab2: eine Open-Source-Software für die Dekonvolutionsmikroskopie. Methoden 115, 28–41 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schindelin, J. et al. Fidschi: eine Open-Source-Plattform für die Analyse biologischer Bilder. Nat. Methoden 9, 676–682 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jovtchev, G., Schubert, V., Meister, A., Barow, M. & Schubert, I. Der Kern-DNA-Gehalt sowie das Kern- und Zellvolumen korrelieren in Angiospermen positiv. Zytogenet. Genomres. 114, 77–82 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ollion, J., Cochennec, J., Loll, F., Escude, C. & Boudier, T. TANGO: ein generisches Tool für die Hochdurchsatz-3D-Bildanalyse zur Untersuchung der nuklearen Organisation. Bioinformatik 29, 1840–1841 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y. & Gu, J. fastp: ein ultraschneller All-in-One-FASTQ-Präprozessor. Bioinformatik 34, i884–i890 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Cock, PJ et al. Biopython: frei verfügbare Python-Tools für computergestützte Molekularbiologie und Bioinformatik. Bioinformatik 25, 1422–1423 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ Grundlegendes Suchwerkzeug für die lokale Ausrichtung. J. Mol. Biol. 215, 403–410 (1990).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lamesch, P. et al. Die Arabidopsis-Informationsressource (TAIR): verbesserte Genannotation und neue Tools. Nukleinsäuren Res. 40, D1202–D1210 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, H. Ausrichten von Sequenzlesevorgängen, Klonsequenzen und Assemblierungs-Contigs mit BWA-MEM. Vorabdruck unter https://arxiv.org/abs/1303.3997v2 (2013).

Katoh, K. & Standley, DM MAFFT Multiple Sequence Alignment Software Version 7: Verbesserungen bei Leistung und Benutzerfreundlichkeit. Mol. Biol. Entwicklung 30, 772–780 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Van Bel, M. et al. PLAZA 5.0: Erweiterung des Umfangs und der Leistungsfähigkeit der vergleichenden und funktionellen Genomik in Pflanzen. Nukleinsäuren Res. 50, D1468–D1474 (2022).

Artikel PubMed Google Scholar

Danecek, P. et al. Zwölf Jahre SAMtools und BCFtools. GigaScience https://doi.org/10.1093/gigascience/giab008 (2021).

Ramirez, F. et al. deepTools2: ein Webserver der nächsten Generation für die Deep-Sequencing-Datenanalyse. Nukleinsäuren Res. 44, W160–W165 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jasper, F., Koncz, C., Schell, J. & Steinbiss, HH Agrobacterium T-Strang-Produktion in vitro: sequenzspezifische Spaltung und 5′-Schutz einzelsträngiger DNA-Matrizen durch gereinigtes VirD2-Protein. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 91, 694–698 (1994).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kleinboelting, N. et al. Die Strukturmerkmale Tausender T-DNA-Insertionsstellen stimmen mit einem auf der Reparatur von Doppelstrangbrüchen basierenden Insertionsmechanismus überein. Mol. Werk 8, 1651–1664 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Feng, W. et al. Markerfreie Quantifizierung der Reparaturwegnutzung bei Cas9-induzierten Doppelstrangbrüchen. Nukleinsäuren Res. 49, 5095–5105 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken allen aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Jacob-Labors, insbesondere F. Langhammer und G. Villarino, für Reagenzien, Diskussionen und Ratschläge; C. Bolick und seine Mitarbeiter in Yale für ihre Hilfe beim Pflanzenwachstum und bei der Pflege; H. Puchta vom Karlsruher Institut für Technologie für seine großzügigen Schenkungen des in dieser Arbeit verwendeten Gens, das auf binäre Plasmide abzielt; und Marco Molina und Mayra Molina (Multi-Crop Transformation Facility, Texas A&M University) für die Erzeugung der in dieser Studie verwendeten transgenen Tabakpflanzen. Dieses Projekt wurde durch den Zuschuss R35GM128661 der National Institutes of Health (YJ) und einen NIH Director's New Innovator Award (DP2GM137414 an SW) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Lauren Dickinson, Wenxin Yuan.

Abteilung für Molekular-, Zell- und Entwicklungsbiologie, Fakultät für Künste und Naturwissenschaften, Yale University, New Haven, CT, USA

Lauren Dickinson, Wenxin Yuan, Chantal LeBlanc, Geoffrey Thomson und Yannick Jacob

Abteilung für Genetik, Yale School of Medicine, Yale University, New Haven, CT, USA

Siyuan Wang

Abteilung für Zellbiologie, Yale School of Medicine, Yale University, New Haven, CT, USA

Siyuan Wang

Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, Yale University, New Haven, CT, USA

Yannick Jacob

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YJ überwachte die Studie und entwarf die Experimente mit LD und WY. Alle Experimente wurden von LD und WY durchgeführt, mit Ausnahme der gezielten Mutagenesearbeit (durchgeführt von CL) und der bioinformatischen Analysen (durchgeführt von GT). SW hat die Sonden für die FISH-Experimente entworfen. YJ und CL haben den Artikel geschrieben, mit Beiträgen von LD und WY

Korrespondenz mit Yannick Jacob.

Eine Patentanmeldung (Patentanmeldung Nr. 63/481,276, US-Patent- und Markenamt, 24. Januar 2023) mit YJ, LD und WY als Erfindern bezog sich auf die Verwendung repetitiver Sequenzen und genetischer Mutationen zur Regulierung der T-DNA-Kopienzahl und Verbesserung der Genbearbeitung, wurde eingereicht. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Plants dankt Avraham Levy, Damon Lisch und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, DNA-qPCR von ALS in Col-0- (nicht transformierten) und T1-Pflanzen, die für das FISH-Experiment verwendet wurden (Panel b und Abb. 1e). Punkte stellen DNA-Proben aus einzelnen Blättern derselben T1-Pflanze dar (n = 4 für Col-0, ONSEN RT #1 und ONSEN RT #2, n = 3 für No RT). Horizontale Balken geben den Mittelwert an. SD wird angezeigt. b, FISH in Blattkernen, die auf die T-DNA-Sequenz abzielen. Die Kerne wurden mit DAPI und Sonden für ALS (grün) und NPTII (rot) gefärbt. Das FISH-Experiment wurde >3 Mal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.

a, DNA-qPCR von ALS in den No RT- und ONSEN RT T1-Pflanzen, die für die Sequenzierung des gesamten Genoms verwendet wurden (Panel b, Abb. 1f, g und Abb. 3b). b, Ortsdiagramme für die identifizierten T-DNA-Insertionen. Die Koordinaten für jede Insertion basieren auf der TAIR10-Annotation und entsprechen den genomischen Grenzen von Arabidopsis, die jede identifizierte T-DNA umgeben. Bei jeder Einfügung stellen die oberen Linien die unveränderte Genomsequenz mit annotierten Genen (Marineblautöne) dar. Rote Pfeile stellen Einfügepunkte dar. Die unteren Zeilen zeigen die Grenzen der Insertion detaillierter, wobei die identifizierte Insertion der binären Vektorsequenz (Nicht-T-DNA-Region) oder der T-DNA-Komponenten gezeigt wird. Gestrichelte Linien stellen zusammenhängende T-DNA-assoziierte Kassetten dar. Rote Balken zeigen die binäre Vektorsequenz (Nicht-T-DNA) an. Dunkelblaue Balken (LB) und hellgraue Balken (pea3A(T)) zeigen das 5′-Ende des T-DNA-Konstrukts an (obwohl es im Pflanzengenom in 5′- oder 3′-Ausrichtung vorliegen kann). Dunklere graue Balken neben den roten Balken sind Füllsequenzen und der blaugrüne Balken stellt die NPTII-Sequenz dar.

a, Schematische Darstellung der sgRNA-Gendeletion aus dem No RT-Vektor. b, DNA-qPCR von ALS in Col-0 (nicht transformiert) und in T1-Pflanzen, transformiert mit dem No RT-Plasmid und dem No RT-Plasmid mit deletiertem sgRNA-Gen. Jeder Punkt stellt eine einzelne Pflanze dar (n = 21 für Col-0, n = 26 einzelne T1-Pflanzen für No RT und No RT, sgRNA-Gendeletionen). Horizontale Balken geben den Median an. PCol-0 = 0,00000002, ns = nicht signifikant unterschiedlich (Kruskal-Wallis ANOVA gefolgt von Dunn-Test). C. Schematische Darstellung der sgRNA-Gendeletion aus dem ONSEN RT-Vektor. D. DNA-qPCR von ALS in Col-0 (nicht transformiert) und in T1-Pflanzen, die mit dem ONSEN RT-Plasmid und dem ONSEN RT-Plasmid transformiert wurden, wobei beide sgRNA-Gene gelöscht wurden. Jeder Punkt repräsentiert eine einzelne Pflanze (n = 22). Horizontale Balken geben den Median an. PCol-0 = 0,00000004, ns = nicht signifikant unterschiedlich (Kruskal-Wallis ANOVA gefolgt von Dunn-Test). e. DNA-qPCR von ALS in Tabakpflanzen, die durch biolistisches Bombardement mit Partikeln transformiert wurden, die mit No RT- oder ONSEN RT-Plasmid-DNA beschichtet waren. Jeder Punkt repräsentiert eine einzelne Pflanze. Horizontale Balken geben den Median an. ns = nicht signifikant unterschiedlich (zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test). ns, P > 0,05; ****, P < 0,0001.

Quelldaten

a, Mehrfachsequenz-Alignments von Übergängen zwischen zwei T-DNA-Sequenzen, gruppiert nach der Orientierung der beiden Sequenzen (RB-LB, LB-LB oder RB-RB). Referenzsequenzen wurden unter der Annahme konstruiert, dass T-DNA-Moleküle unmittelbar stromaufwärts der Endonuklease (VirD2)-Erkennungssequenz (5′-CAGGATATATT-3′) begannen und endeten63,64. Füllsequenzen sind rot und Sequenzen, die mit mikrohomologiebedingten Deletionen übereinstimmen, sind unterstrichen. Wenn Füllsequenzen eine ähnliche Sequenz in der Nähe haben, werden diese (und die benachbarte Sequenz) ebenfalls unterstrichen. Sternchen kennzeichnen identische Kreuzungen, die in unabhängigen Anlagen vorkommen. b, Darstellung von T-DNA-Verbindungen mit einer anderen T-DNA oder binären Vektorsequenz, die intern nicht unmittelbar an den LB oder RB angrenzt. C. Klassifizierung der RB-LB-, LB-LB- und RB-RB-Sequenzen für jede T1-Linie nach einem zuvor beschriebenen Verfahren65. NHEJ (<4 bp-Deletionen und <5 bp-Insertionen), Insertionen (≥5 bp mit jeder Deletion), Nicht-Mikrohomologie (Nicht-MH; ≥4 bp-Deletion oder <5 bp-Insertionen mit Mikrohomologien <2) und Mikrohomologie (MH ; ≥4 bp Deletion mit Mikrohomologien ≥2). Die letzten drei sind mit der DNA-Polymerase Theta verbunden.

a, DNA-qPCR von ALS in Col-0-, atxr5/6- und tsk-Pflanzen, transformiert mit dem ONSEN RT-Konstrukt. Jeder Punkt repräsentiert eine einzelne T1-Pflanze (n = 24). Horizontale Balken geben den Median an. ns = nicht signifikant unterschiedlich (Kruskal-Wallis ANOVA gefolgt von Dunn-Test). b, DNA-qPCR von ALS in DNA, die 16 Tage und 30 Tage nach der Keimung aus Blättern von T1-Pflanzen extrahiert wurde.

Quelldaten

A. Genstruktur von CRY2. Graue Balken stellen Exons dar und blaue Balken stellen Regionen dar, auf die sgRNAs abzielen. b, c. INDEL-Häufigkeit von CRY2-PCR-Produkten, die aus DNA amplifiziert wurden, die aus Blättern einzelner T1-Pflanzen extrahiert wurde, die entweder mit No RT- oder ONSEN RT-Konstrukten transformiert wurden. Konstrukte trugen entweder (b) sgRNA #2 oder (c) sgRNA #3. D. DNA-qPCR von ALS in T1-Pflanzen ohne nachweisbare CRY2-Indels (No indels) oder nachweisbare Indels (Indels) unter Verwendung von CRY2 sgRNA #3. Jeder Punkt repräsentiert eine einzelne T1-Pflanze (n = 20). Horizontale Balken geben den Median an. *P = 0,0350 (zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test) e. DNA-qPCR von ALS in T1-Pflanzen ohne RT und ONSEN RT (grau) im Verhältnis zum Prozentsatz der echten (nicht-ektopischen) Gen-Targeting-Raten in der T2-Generation (rot).

Quelldaten

Das Modell baut auf dem T-DNA-Integrationsmodell von Kralemann et al., 20226 auf. Die chromosomale Erfassung eines T-DNA-Strangs am 3′-Ende wird durch TMEJ vermittelt. Nach der Umwandlung in ein doppelsträngiges T-DNA-Zwischenprodukt wird das Einfangen des 5′-Endes der T-DNA durch Entfernung des Agrobacterium-Proteins VirD2 durch TDP2 oder MRE11 erreicht. Durch die TDP2-vermittelte Entfernung von VirD2 entsteht am 5′-Ende der T-DNA stumpfe DNA, die durch NHEJ an das Chromosom ligiert wird. Im Gegensatz dazu entfernt MRE11 als Teil des MRN-Komplexes (MRE11-RAD50-NBS1; durch RAD1725 auf die DNA geladen) VirD2, indem es die T-DNA intern schneidet, wodurch ein versetztes Ende am 5′-Ende der T-DNA entsteht. Die TDP2/NHEJ-Aktivität führt zu einer einzelnen T-DNA-Kopienintegration (Ergebnis A), während die MRE11/TMEJ-Aktivität zu mehreren Ergebnissen führt (BE), wobei das einfachste die chromosomale Erfassung des 5′-Endes der T-DNA ist (Ergebnis B). . Alternativ kann das versetzte 5′-Ende der T-DNA die Rekrutierung zusätzlicher T-DNA-Stränge für die Ligation erleichtern, was zu einer Verkettung führt. Die Erfassung des 5′-Endes eines zusätzlichen T-DNA-Strangs durch TDP2/NHEJ anstelle von MRE11/TMEJ beendet den Verkettungszyklus mit größerer Wahrscheinlichkeit. In diesem Modell können T-DNA-Merkmale wie DNA-Wiederholungen den Verkettungsgrad erhöhen, indem sie die Anzahl der für die Integration verfügbaren T-DNA-Stränge und/oder ihre Zugänglichkeit erhöhen. ssDNA: einzelsträngige DNA. dsDNA: doppelsträngige DNA. Erstellt mit BioRender.com.

Ergänzende Tabelle 1. Liste der für die FISH-Analyse verwendeten Sonden und Primer.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

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Dickinson, L., Yuan, W., LeBlanc, C. et al. Regulierung der Genbearbeitung mittels T-DNA-Verkettung. Nat. Pflanzen (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-023-01495-w

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Eingegangen: 31. Oktober 2022

Angenommen: 18. Juli 2023

Veröffentlicht: 31. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-023-01495-w

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